河北來復醫(yī)藥科技有限公司
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25-羥基維生素D，簡稱25-OH VD，包括25-羥基維生素D2（25-OH VD2）和25-羥基維生素D3（25-OH VD3）作為維生素D在體內的主要代謝形式之一，由于其半衰期長、存在形式穩(wěn)定而被認為是維生素D營養(yǎng)水平的標志物。如何快速準確檢測人體內維生素D的水平越來越受到廣大學者和醫(yī)患人員的重視。液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）具有特異性強、準確性高的特點，被認為是評價維生素D營養(yǎng)狀況的"黃金標準"測定法。本應用案例采用Cleanert SLE 96孔板進行血清樣品前處理，并使用LC-MS/MS進行樣品測試，結果表明該實驗方法具有良好的穩(wěn)定性及可靠性，可為臨床研究提供一種解決方案。
目標物信息
材料及儀器
Cleanert SLE 96孔板（300mg/well）、Cleanert M96 生物樣品前處理儀、Cleanert V96 樣品氮吹濃縮儀、96孔接收板及Durashell C18-L（3.0*50 mm, 5 μm, 150 ?）均來自天津博納艾杰爾科技有限公司；LC-MS/MS, QTRAP 5500（SCIEX）；25-OH VD2，25-OH VD3，d3-25-OH VD2以上三種標準品由合作單位提供贊助；d6-25-OH VD3（購自Altascientific）；甲醇；甲酸；水；氫氧化鈉；異辛烷。
樣品處理方法
樣品預處理
取100 μL血清至潔凈樣品瓶中，加入內標溶液，再加入100 μL 50 mM氫氧化鈉水溶液混勻后待凈化。
SLE過程
上樣：把預處理的樣品全部上樣，待全部浸潤后靜置5 min。
洗脫：用2 mL的異辛烷進行洗脫，每次洗脫加入500 μL，最后一步洗脫結束，將Cleanert SLE與收集板整體放到Cleanert M96 生物樣品前處理儀上，開啟壓力至0.02 MPa，約30 s，完全收集洗脫液。
將洗脫液室溫下用Cleanert V96 樣品氮吹濃縮儀進行溫和氮吹干，使用200 μL 0.1% FA 甲醇/水（8/2）復溶，進樣檢測。
儀器檢測條件
HPLC條件
色譜柱：Durashell C18-L（3.0*50 mm, 5 μm, 150 ?）
流速：500 μL/min
柱溫：30 ℃
進樣量：5 μL
表1 液相條件
|
Step |
Total Time(min) |
Flow Rate(μL/min) |
0.1%甲酸 水 (%) |
0.1%甲酸甲醇 (%) |
|
0 |
0 |
500 |
10 |
90 |
|
1 |
3.5 |
500 |
10 |
90 |
質譜條件
掃描模式：電噴霧電離正模式
采集模式：多反應監(jiān)測（MRM）
表2 參數信息
|
化合物 |
保留時間/min |
Q1 |
Q3 |
CE |
|
25-OH VD2 |
1.81 |
413.3 |
395.3 |
13.5 |
|
413.3 |
355.4 |
14.1 |
||
|
d3-25-OH VD2 |
1.79 |
416.5 |
398.4 |
12.3 |
|
416.5 |
358.5 |
15 |
||
|
25-OH VD3 |
1.71 |
401.5 |
383.5 |
13.8 |
|
401.5 |
365.5 |
15.1 |
||
|
d6-25-OH VD3 |
1.69 |
407.5 |
389.5 |
13.8 |
|
407.5 |
371.5 |
15.1 |
結果
線性范圍與靈敏度
使用不含目標物的血清樣品配制10個不同濃度的校準曲線點，25-OH VD2的濃度分別為：2、4、10、30、60、120、200、400、800、1000 ng/mL；25-OH VD3的濃度分別為：1、2、5、15、30、60、100、200、400、500 ng/mL；所得樣品采用上述樣品前處理方法凈化樣品并進行檢測，獲得結果見表3。
表3 線性范圍及靈敏度
|
化合物 |
回歸方程 |
相關系數（r2） |
方法定量限LOQ(ng/mL) |
|
25-OH VD2 |
y=0.00691x+0.043 |
0.9998 |
1.1 |
|
25-OH VD3 |
y=0.0203x+0.398 |
0.9995 |
0.16 |
方法精密度與準確度
為考察方法精密度與準確度，取低、中、高三個濃度的樣本，每個濃度平行處理5個樣，獲得數據見表4.
表4 精密度與準確度
|
化合物 |
加標濃度 |
平均回收率 |
RSD |
|
25-OH VD2 |
4 |
101.8% |
8.3% |
|
30 |
95.6% |
7.2% |
|
|
200 |
96.8% |
4.0% |
|
|
25-OH VD3 |
2 |
100.4% |
12.9% |
|
15 |
95.0% |
6.1% |
|
|
100 |
93.5% |
4.3% |
色譜圖
將經Cleanert SLE凈化的樣品按上述LC-MS/MS測試條件進行測試，獲得譜圖見圖3-4.
血樣中大量存在的磷脂是造成液質聯用基質效應的主要原因，為考察PPT、LLE與Cleanert SLE技術去除磷脂的能力，特取磷脂兩對特征離子對進行考察：496/184, 524/184，獲得對比圖見圖5-6.
圖3 25-OH VD3血清加標色譜圖（濃度為15 ng/mL）
圖4 25-OH VD2血清加標色譜圖（濃度為30 ng/mL）
圖5 PPT-LLE-SLE樣品磷脂對比譜圖（離子對496/184）
圖6 PPT-LLE-SLE樣品磷脂對比譜圖（離子對524/184）
結論
本應用呈現了一種簡單、高效的樣品前處理方法，通過Cleanert SLE 96孔板可高通量凈化血樣并萃取富集脂溶性維生素D代謝物25-OH VD2與25-OH VD3，本實驗方法易操作且穩(wěn)定，可在臨床研究及藥物代謝領域替代耗時、低效的液液萃取技術。
訂貨信息表
|
產品名稱 |
規(guī)格/包裝 |
訂貨號 |
|
Cleanert SLE 96孔板 |
96孔板 |
HC2002SQ-9W |
|
Cleanert M96 生物樣品前處理儀 |
與96孔板匹配 |
SPE-M96 |
|
Cleanert V96 樣品氮吹濃縮儀 |
與96孔板匹配 |
NV-96G |
|
96孔收集板 |
2 mL/well，與96孔板匹配 |
96SP2036-2 |
|
Durashell C18-L |
3.0*50mm，5μm，150 ? |
DC950503-L |
|
甲醇 |
LC-MS級, 4*2.5L |
LC230 |
|
水 |
LC-MS級，4*2.5L/箱 |
LC365 |
應用編號：YB10011
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